✂️ CRISPR-Cas9
Пройдіть покроково найпотужніший інструмент редагування генів: направляюча РНК спрямовує білок Cas9 до точного місця в геномі, подвійна спіраль розкручується, 20 пар основ перевіряються одна за одною, обидва ланцюги ДНК розрізаються — потім клітина відновлює розрив за допомогою схильного до помилок NHEJ або точного HDR.
Механізм CRISPR-Cas9 (Jinек та ін., 2012)
CRISPR (Кластерні Регулярно Інтервальовані Короткі Паліндромні Повтори) було адаптовано з імунної системи бактерій у програмований інструмент редагування геному. Два ключових компоненти:
- Білок Cas9 — молекулярні ножиці з двома нуклеазними доменами (RuvC та HNH), кожен розрізає один ланцюг ДНК.
- Направляюча РНК (gRNA) — ~100 нт РНК: 20-нт спейсер (комплементарний до мішені), злитий з каркасом, що зв'язується з Cas9.
Cas9 спочатку сканує ДНК у пошуку послідовності PAM (5′-NGG-3′) на некодуючому ланцюзі. Знайшовши її, він локально розкручує спіраль і перевіряє комплементарність між спейсером і мішенню. При майже ідеальному збігу відбувається розрізання на 3 п.о. вищестрімно від PAM, утворюючи тупий двониткий розрив (DSB).
Клітина відновлює DSB одним із двох шляхів: NHEJ (нерекомбінаційне злиття кінців) — швидкий, але схильний до помилок, малі індели порушують функцію гена — або HDR (репарація за допомогою гомологічного шаблону) — точне виправлення з донорним шаблоном, але лише в клітинах, що діляться.